Príprava preparátu na pozorovanie
Rôzne vzorky určené na rôzne účely potrebujú aj rôzne úpravy či postupy pri ich tvorení. Najvhodnejší na pozorovanie cez mikroskop je čerstvý materiál bez použitia fixatív a farbív z týchto dôvodov:
- zostávajú zachované prirodzené farby pozorovaných štruktúr,
- dochádza iba k obmedzenej extrakcii rozpustných látok ako sú roztoky obsiahnuté v sekretórnych orgánoch alebo bunkách,
- dochádza iba k menšiemu poškodeniu prirodzených tvarov a veľkostí buniek ako pri použití iných metód,
- výsledky a možnosť pozorovania štruktúr sú okamžité.
Postup prípravy preparátu:
- Odporúča sa odobrať viac vzoriek, lebo sa môže stať, že dôjde k znehodnoteniu, a vy by ste tak o vzorku prišli.
- Ak budete pozorovať preparáty na účely vedeckého pokusu, určite by malo byť sklíčko vždy nové, teda aj čisté. Ak použijete už použité sklo, to sa opláchne najskôr vo vode saponátom, potom sa opláchne 70% etanolom. Po vyčistení berieme sklo do rúk iba za hrany, aby sme nezanechali otlačky prstov.
- Na vyčistené podložné sklíčko pomocou kvapátka kvapneme do stredu kvapku montovacieho média, v priemere asi 5-7 mm. V cvičení sa bude najčastejšie jednať o vodu, ale môže to byť napr. aj glycerol a pod.
- Do kvapky vložíme vhodne upravený objekt (celý orgán, rez, stiahnutú pokožku, atď.)pomocou štetčeka alebo pinzety. V prípade natívneho preparátu dbáme na to, aby objekt po celú dobu prípravy i vlastného pozorovania zostal živý.
- Krycie sklíčko priložíme hranou ku kvapke média. To sa roztečie pozdĺž hrany krycieho skla. Krycie sklo potom podoprieme na protiľahlej strane preparačnou ihlou, ktorou opatrne a pomaly sklápame krycie sklo tak, aby sa v médiu neurobili bubliny. Krycie sklo pritom môžeme pridržovať za hrany medzi palcom a ukazovákom.
- Zaistíme, aby sa objekt medzi krycím a podložným sklíčkom nepohyboval.
- Ak je časť priestoru medzi sklami vyplnená vzduchom, je média málo a hrozí nebezpečie vyschnutia pozorovaného objektu. V tomto prípade pridáme opatrne kvapátkom kvapku k hrane krycieho skla tam, kde je tekutina a nie vzduch. Tekutina prenikne pod krycie sklo.
- Ak je média príliš veľa, krycie sklíčko "pláva" a pohybuje sa spolu s montovaným objektom. V tomto prípade opatrne odsajeme prebytok média zo strany kúskom filtračného papiera alebo buničitej vaty.
Dôležité upozornenia pri príprave preparátu:
- Ak sú v preparáte bubliny, je zvyčajne nutné ho premontovať. "Vypudzovanie" bublín zvyčajne nevedie k žiadúcemu cieľu.
- Krycie sklíčko musí byť menšie než podložné a má ležať rovnako ako objekt približne uprostred podložného sklíčka.
- Pred mikroskopovaním zaistíte, aby ani stolček mikroskopu ani spodok podložného skla neboli vlhké. Rovanko nesmie byť médium na krycom sklíčku.
Príprava vzorky pre elektrónovú mikroskopiu
- Dôležitým predpokladom je, že preparát nebude obsahovať vodu. V elektrónovom mikroskope je preparát vystavený vákuu, vďaka ktorému by sa voda v preparáte uvoľňovala. Vďaka uvoľnenej vode by mohlo dôjsť hneď k niekoľkým problémom. Prvým by bolo znehodnotenie preparátu, druhým problémom by potom bol fakt, že by uvoľnená voda spomaľovala elektróny.
- Preparát by rovnako nemal prekročiť veľkosť 100 nm. Keby bol preparát silnejší, elektróny by cez neho jednoducho neprešli. Keď už by sa im to predsa len podarilo, poskytovali by príliš skreslený a nepresný obraz.
- U prípravy preparátu pre elektrónovú mikroskopiu začneme vyrezaním vhodnej veľkosti preparátu z iného, väčšieho. Orezanie sa vykonáva zásadne skalpelom. Ak sa bude jednať o bunky, musíme ich fixovať rôznymi roztokmi v rôznom zložení. Dôležitú úlohu hrá aj pH (kyslosť). Ako bolo spomenuté v bode 1, zo vzorky treba odviazať vodu.
- Dehydratácia preparátu prebieha pomocou acetónu. Ten sa nariedi na rôzne koncentrácie, a bunka sa do neho jednoducho ponorí. Takto upravené vzorky potom fixujeme pomocou propylénoxidu. Bunky (tkanivo) sa zaleje do syntetickej živice, nasleduje polymerizácia. Po týchto úpravách vzorku orežeme na ultramikrotome. Tieto rezy sú už pripravené na sledovanie v elektrónovom mikroskope.
Príprava mikroskopov
1. Stav mikroskopu
Pred pozorovaním je potrebné pripraviť nielen preparát, ale aj mikroskop. Prvá vec, ktorá by sa mala zistiť, je stav mikroskopu. Zistiť, či je v poriadku okulár a šošovky. Tieto nesmú byť prasknuté alebo inak poškodené, mohli by skresľovať výsledky.
2. Čistota pracovného stolíka
Musí byť zaistená čistota pracovného stolíka. Keď by bol stolík akýmkoľvek spôsobom znečistený, mohlo by dôjsť aj ku kontaminácii a následnému znehodnoteniu preparátu.
3. Kontrola zdrojov osvetlenia
Ďalšou dôležitou vecou, pred začatím sledovania, je kontrola zdrojov osvetlenia. U zrkadlových mikroskopov sa musí dbať na čistotu zrkadla, rovnako tak by zrkadlo nemalo byť prasknuté. Od prasklín by sa svetlo neodrážalo priamo do okulára a sledovacie podmienky by tak boli značne zhoršené. U LED osvetlenia potom skontrolujeme, či sú diódy v poriadku. Halogénové zdroje potom vyžadujú kontrolu žiarivosti.
4. Čistota prostredia a nástrojov
Či už sa bude jednať o prípravu preparátov alebo mikroskopov, vždy dbajte predovšetkým na čistotu prostredia a nástrojov, rovnako tak ako na precíznosť. S precízne pripraveným preparátom a mikroskopom ste potom schopní pozorovať a skúmať vzorky presnejšie a detailnejšie.